J Adv Res|浙江大學(xué)團(tuán)隊(duì)揭示黑木耳多糖通過腸道共生菌改善肥胖

2024-07-15

黑木耳（Auricularia auricula）是一種傳統(tǒng)的食藥兩用真菌，是世界上第三大栽培食用菌，因其豐富的生物活性成分和保健作用而引起越來越多的研究興趣。黑木耳的子實(shí)體含有豐富的多糖，在東方國(guó)家被用作食品和藥物已有1000多年的歷史。黑木耳的主要功能成分是多糖，具有重要的生物學(xué)作用，如抗氧化、降血糖、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗病毒活性。然而，黑木耳多糖(AAP)是否對(duì)體重和肥胖相關(guān)的代謝紊亂有直接影響仍未知。

浙江大學(xué)的靳明亮團(tuán)隊(duì)在Journal of Advanced Research雜志上撰文，闡釋AAP通過調(diào)節(jié)腸道脂質(zhì)運(yùn)輸來抑制飲食驅(qū)動(dòng)的肥胖和基于新陳代謝的疾病，這一機(jī)制依賴于腸道共生的Papillibacter cinnamivorans。

為了研究AAP對(duì)飲食誘導(dǎo)的肥胖的影響，小鼠進(jìn)行8周HFD喂養(yǎng)，每天灌胃AAP或生理鹽水(陰性對(duì)照)。在這8周之后，HFD組的體重顯著增加，AAP從第二周起改善了飲食導(dǎo)致的體重增加。組織學(xué)分析證實(shí)，AAP可減少腹部脂肪沉積和脂肪細(xì)胞大小，同時(shí)肝臟和心臟重量降低，但腎和脾重量沒有差異。對(duì)腹部脂肪的進(jìn)一步分析表明，HFD上調(diào)脂肪生成基因(Pparγ和Cebpα)和脂肪生成基因(Acc1和Fasn)，而AAP處理下調(diào)。此外，AAP還能抑制HFD誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性和血脂紊亂，表現(xiàn)為減少甘油三酯在肝臟內(nèi)的積聚，降低血漿甘油三酯、膽固醇和LDL水平。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)，AAP可以緩解HFD誘導(dǎo)的高血糖，表現(xiàn)為在OGTT過程中血糖水平較低，這表明AAP增強(qiáng)了攝入后葡萄糖的清除。為了進(jìn)一步闡明AAP對(duì)HFD誘導(dǎo)的肥胖和相關(guān)代謝紊亂的影響，研究者進(jìn)行了代謝組學(xué)分析，比較了HFD小鼠和服用AAP的小鼠的血清代謝組，并以喂LFD（低脂飲食）的小鼠為對(duì)照。發(fā)現(xiàn)HFD、HFD+AAP和LFD喂養(yǎng)的小鼠之間的血清代謝物得到了明確的分離。對(duì)單個(gè)代謝物的進(jìn)一步分析表明，經(jīng)HFD升高的11種代謝物的含量被AAP完全逆轉(zhuǎn)至正常水平。代謝通路分析表明，顯著變化的幾種代謝物與參與脂肪酸代謝的代謝通路有關(guān)?？傊?，這些結(jié)果表明，口服AAP預(yù)防HFD誘導(dǎo)的肥胖及其代謝紊亂，可能是通過與脂肪酸代謝有關(guān)。

口服AAP可避免飲食引起的肥胖和代謝紊亂

為了確定腸道微生物群是否在AAP誘導(dǎo)的肥胖和相關(guān)疾病的影響中發(fā)揮作用，將HFD小鼠灌胃抗生素雞尾酒處理。當(dāng)小鼠接受抗生素處理時(shí)，AAP未能減弱HFD誘導(dǎo)的體重增加，在器官重量中結(jié)果類似。使用或不使用APP處理的小鼠的脂肪在腹部脂肪重量、脂肪細(xì)胞大小或脂肪生成相關(guān)基因的表達(dá)方面也沒有差異。此外，抗生素處理消除了AAP對(duì)HFD誘導(dǎo)的代謝紊亂的影響，包括肝臟TG水平、循環(huán)TG水平、TCHO和LDL水平以及葡萄糖耐量。總之，AAP的抗肥胖作用依賴于多樣的腸道微生物群落的存在。

腸道微生物群對(duì)AAP抗肥胖至關(guān)重要

為了進(jìn)一步闡明腸道微生物群在AAP誘導(dǎo)效應(yīng)中的作用，采用FMT進(jìn)行驗(yàn)證。來自HFD小鼠的糞便微生物群被移植到HFD受體小鼠中。與對(duì)照組小鼠相比，AAP處理的小鼠的FMT顯著降低了體重增加和器官重量。然而，AAP加抗生素處理的小鼠的FMT受體小鼠與HFD小鼠沒有區(qū)別。同樣，與HFD-FMT受體小鼠相比，AAP-FMT受體小鼠的肝臟和循環(huán)甘油三酯，以及血清T-CHO和LDL水平顯著低于HFD-FMT受體小鼠，這表明AAP影響的糞便微生物群落的移植也降低了脂肪代謝。研究者進(jìn)一步分析了腹部脂肪沉積和脂肪生成相關(guān)基因的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)HFD對(duì)照組和AAP+抗生素處理的小鼠的FMT受體小鼠各基因之間表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異，而接受AAP-FMT的小鼠的基因表達(dá)水平顯著降低。此外，AAP-FMT受體小鼠的血糖上升也明顯減少，而抗生素處理消除了了AAP-FMT的影響。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了微生物群在AAP的抗肥胖作用中的作用。

來自AAP處理小鼠的FMT減少了HFD小鼠的肥胖和代謝紊亂。

為了進(jìn)一步了解腸道微生物群在AAP減肥中的作用，研究者通過16S rRNA基因擴(kuò)增序列分析了腸道微生物群的組成。雖然α多樣性在組之間沒有差異，但組間的β多樣性，如PCoA所示，根據(jù)處理組顯示出四個(gè)獨(dú)立的簇，這表明腸道微生物群組成對(duì)HFD、AAP和抗生素干預(yù)的反應(yīng)存在差異。Lefse分析用于鑒定AAP在HFD小鼠體內(nèi)影響的微生物分類群。在屬水平上，與LFD相比，HFD改變了8個(gè)屬(增加了5個(gè)屬，減少了3個(gè)屬)，包Lachnoclostridium, 腸球菌屬, Negativibacillus, 嗜水氣單胞菌, Hypnocyclicus, Candidatus，Bacilloplasma, Papillibacter和雙歧桿菌。與HFD小鼠相比，AAP治療顯著降低了Mucispirillum的水平，增加了可被抗生素消除的Peptococcus, Muribaculum, Anaerovorax和 Papillibacter,的水平。值得注意的是，只有Papillibacter的水平被HFD抑制，并可以被AAP恢復(fù)。研究者通過GenBank序列數(shù)據(jù)庫(kù)檢索AAP組與其他HFD組差異顯著的OTUS。在全部范圍內(nèi)，71個(gè)菌OUT被HFD顯著影響，而AAP移動(dòng)了影響了83個(gè)菌OTU。進(jìn)一步評(píng)估了三個(gè)不同實(shí)驗(yàn)組之間的OUT交集，包括正常飲食與HFD組，HFD組與HFD+AAP組，以及HFD+AAP組與HFD+AB+AAP組。得到了16個(gè)OTUS，包括P. cinnamivorans, Parabacteroides goldsteinii, Alistipes putredinis, Clostridium saccharolyticum, Caprobacter fermentans, Clostridium thermocellum, Massilimaliae timonensis, Clostridium fessum, Acetatifactor muris, Paramuribaculum intestinale, Aminipila butyrica, Clostridium indolis, Clostridium celerecrescens, Muribaculum intestinale, Kineothrix alysoides和 Faecalicatena orotica。因此，該研究集中在肥胖相關(guān)趨勢(shì)與通過AAP調(diào)節(jié)的細(xì)菌種類的腸道水平相關(guān)的可能性上。相關(guān)分析表明，OTU17(P.Golddsteinii)、OTU22(A.putredinis)和OTU56(P.Cinnamivorans)與肥胖顯著負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果表明，AAP以腸道微生物群特異性的方式調(diào)節(jié)HFD誘導(dǎo)的肥胖。

AAP治療肥胖小鼠腸道微生物群的變化

由于AAP的減肥效果可以通過FMT轉(zhuǎn)移，因此通過對(duì)受體糞便樣本進(jìn)行16S rRNA基因組測(cè)序，評(píng)估了轉(zhuǎn)移供體糞便微生物區(qū)系對(duì)微生物多樣性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)主要不影響微生物區(qū)系的α多樣性(圖5A)。為了說明FMT處理對(duì)β多樣性的影響，研究發(fā)現(xiàn)HFD、AAP和抗生素組之間存在顯著差異，這表明FMT復(fù)制了AAP對(duì)HFD誘導(dǎo)的肥胖小鼠腸道微生物區(qū)系的影響。研究者共鑒定出54個(gè)差異較大的菌屬，其中14個(gè)屬是三組間共有的。在這些屬中，與AAP-FMT受體相比，經(jīng)抗生素處理的受體小鼠糞便菌落顯著改變了9個(gè)屬，包括Aerosphaera, Gemella, Coriobacteriaceae, Facklamia, Corynebacterium, Kurthia, Aerococcus, Ruminococcaceae, Glutamicibacter，而在移植HFD小鼠糞便微生物群的小鼠中，7個(gè)屬受到調(diào)控，包括Psychrobacter, Ruminococcaceae, Glutamicibacter, Eubacterium nodatum group, Fusobacterium, Faecalibacterium, Prevotella。此外，利用GenBank序列數(shù)據(jù)庫(kù)，研究者分析了三組間OTUS的差異。與HFD-FMT相比，AAP-FMT處理的小鼠中有26個(gè)OTU被確定為移位物種，與AAP-FMT處理的小鼠相比，抗生素-FMT處理的小鼠中有24個(gè)OTU發(fā)生了改變。發(fā)現(xiàn)除了OTU277_Roseburia enterinalis外，與HFD-FMT隊(duì)列相比，AAP-FMT隊(duì)列中有五個(gè)OTU重疊增加，但是在抗生素-FMT隊(duì)列中沒有增加。AAP和AAP-FMT治療的小鼠出現(xiàn)了肥胖減輕，因此，在這兩個(gè)組的糞便樣本中都應(yīng)該存在抗肥胖的腸道共生功能細(xì)菌。令人驚訝的是，從這兩種測(cè)序方法的比較中只發(fā)現(xiàn)了OTU5_P. cinnamivorans。相關(guān)分析的結(jié)果表明，P. cinnamivorans的相對(duì)豐度與肥胖趨勢(shì)呈負(fù)相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，P. cinnamivorans可能是AAP在減少HFD誘導(dǎo)的肥胖方面的關(guān)鍵因素。

P. cinnamivorans被確定為AAP降低飲食誘導(dǎo)的肥胖的關(guān)鍵細(xì)菌

為了證實(shí)P. cinnamivorans促進(jìn)了HFD小鼠的抗肥胖作用，研究者每天給藥HFD小鼠一種商品化的P. cinnamivorans或生理鹽水(對(duì)照)，持續(xù)8周。在4周的處理后，糞便樣本中的P. cinnamivorans的相對(duì)豐度顯著增加。此外，相對(duì)于HFD小鼠，體重增加有所減弱，這些影響持續(xù)到研究的最后4周。P. cinnamivorans處理有效地減少了HFD誘導(dǎo)的肥胖特征，如肝臟和腹部脂肪重量，同時(shí)脂肪細(xì)胞的平均大小和腹部脂肪組織的平均脂肪細(xì)胞面積減少。然后，研究者通過比較對(duì)照組和P. cinnamivorans處理的小鼠，評(píng)估了腹部脂肪中脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)P. cinnamivorans也顯著降低了Cebpα和Pparα的表達(dá)。此外，與HFD小鼠相比，P. cinnamivorans處理的小鼠葡萄糖耐量改善。表明P. cinnamivorans處理可以保護(hù)小鼠免受HFD誘導(dǎo)的肥胖和代謝紊亂的影響。

P. cinnamivorans的治療保護(hù)小鼠免受飲食驅(qū)動(dòng)的肥胖和代謝紊亂的影響。

在確定P. cinnamivorans可以減輕肥胖表型之后，研究者試圖探索這些效應(yīng)背后的機(jī)制。因此，研究者進(jìn)行了批量RNA測(cè)序(RNA-seq)分析，以更全面地分析LFD小鼠、HFD喂養(yǎng)小鼠和HFD-P. cinnamivorans小鼠結(jié)腸組織的基因表達(dá)譜。與HFD組相比，在P. cinnamivorans治療組獲得的2571個(gè)基因中，1335個(gè)上調(diào)，1236個(gè)下調(diào)。KEGG富集分析表明，炎癥相關(guān)通路位于HFD與LFD和P. cinnamivorans與HFD的兩個(gè)簇的重疊處，包括JAK-STAT信號(hào)通路、抗原處理和呈遞、炎癥性腸病和趨化因子信號(hào)通路。因此，為了進(jìn)一步究P. cinnamivorans在HFD介導(dǎo)的腸道炎癥中的作用，研究者測(cè)定了腸道炎癥反應(yīng)。H&E染色形態(tài)分析顯示HFD可引起較大的組織損傷，表現(xiàn)為腸上皮層廣泛潰爛、水腫、腸壁隱窩破壞以及粘膜內(nèi)粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的滲入。相反，P. cinnamivorans處理減少了HFD誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的組織學(xué)病變。為了研究P. cinnamivorans對(duì)HFD誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響，研究了炎癥標(biāo)記物的表達(dá)。P. cinnamivorans處理顯著降低了促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，如TNFa、IL6和IL18。為了驗(yàn)證這些結(jié)果，研究者分析了結(jié)腸和血清中的TNF-α和IL-6的分泌，這與基因表達(dá)的結(jié)果是一致的。此外，為了更深入地了解P. cinnamivorans抗炎作用的分子機(jī)制，研究者對(duì)JAK-STAT信號(hào)通路進(jìn)行了基因集濃縮分析(GSEA)。數(shù)據(jù)顯示，通過分析JAK1、JAK3、AKT3、STAT1和STAT4的轉(zhuǎn)錄水平，P. cinnamivorans處理顯著抑制了HFD小鼠JAK-STAT信號(hào)的激活。提示P. cinnamivorans可通過JAK-STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制HFD誘導(dǎo)的腸道炎癥反應(yīng)。為了研究肉桂嗜酸桿菌對(duì)腸道通透性的影響，研究者用免疫熒光染色和透射電子顯微鏡觀察了緊密連接的形成。透射電子顯微鏡觀察顯示，HFD小鼠腸道組織連接不清，密度降低，細(xì)胞間隙變寬，而P. cinnamivorans處理對(duì)HFD誘導(dǎo)的腸道損傷具有保護(hù)作用。通過對(duì)緊密連接標(biāo)志物Claudin-1、occludin和ZO-1細(xì)胞層的免疫熒光染色，表明存在緊密連接復(fù)合體。此外，P. cinnamivorans處理有效地恢復(fù)了ZO-1的表達(dá)，但不能恢復(fù)Claudin-1和occludin的表達(dá)。與HFD小鼠相比，P. cinnamivorans處理組小鼠的血清內(nèi)毒素或LPS水平也顯著降低，這表明P. cinnamivorans治療降低了HFD小鼠的腸道通透性。因此，P. cinnamivorans在肥胖動(dòng)物體內(nèi)的抗肥胖和抗炎作用與腸道屏障功能增強(qiáng)有關(guān)。

P. cinnamivoran可減輕HFD誘導(dǎo)的肥胖小鼠的炎癥反應(yīng)并增強(qiáng)腸道屏障功能

與HFD小鼠相比，HFD+P. cinnamivorans處理后的表達(dá)降低的基因也顯著富集了與脂肪代謝相關(guān)的通路，如脂肪酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、脂肪酸延長(zhǎng)和亞油酸代謝。因此研究者進(jìn)一步研究P. cinnamivorans是否通過調(diào)節(jié)腸道脂肪吸收來調(diào)節(jié)HFD小鼠的抗炎和抗肥胖作用。利用qPCR分析，研究者證實(shí)了在P. cinnamivorans處理的小鼠中，結(jié)腸和空腸關(guān)鍵脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的mRNA（MTP、ABCA1、FATP4和NPC1）編碼減少。這一變化與血清TG、TC和FFA水平顯著降低有關(guān)。隨后，研究者將肝臟轉(zhuǎn)錄本分為三組。從KEGG結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在P. cinnamivorans（PC）_UP和HFD中，存在某些與肥胖有關(guān)的KEGG通路，特別是產(chǎn)熱通路。因此，研究者研究了實(shí)驗(yàn)中關(guān)于產(chǎn)熱通路相關(guān)基因表達(dá)的數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)與生理鹽水對(duì)照組相比，P. cinnamivorans處理組小鼠肝臟中與產(chǎn)熱信號(hào)相關(guān)的基因上調(diào)。為了進(jìn)一步考察P. cinnamivorans對(duì)肝臟產(chǎn)熱的影響，對(duì)肝臟切片分別進(jìn)行HE染色和透射電子顯微鏡觀察。發(fā)現(xiàn)P. cinnamivorans處理改善肝臟脂肪變性，減輕HFD誘導(dǎo)的脂肪沉積。且P. cinnamivorans處理的小鼠TG水平較低。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了P. cinnamivorans在AAP抗肥胖作用方面的作用，AAP通過調(diào)節(jié)腸道脂肪吸收和肝臟產(chǎn)熱來減輕肥胖。

P. cinnamivorans通過調(diào)節(jié)腸道脂肪吸收和肝臟產(chǎn)熱來減輕由高脂飼料引起的肥胖

總之，該小鼠體內(nèi)研究的結(jié)果表明，AAP（黑木耳多糖）通過微生物群依賴的方式調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、腸道通透性和腸道中的脂肪運(yùn)輸/代謝來減輕肥胖和相關(guān)的代謝失調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)為AAP作為益生菌的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)，同時(shí)也表明有必要進(jìn)一步評(píng)估腸道共生P. cinnamivorans作為潛在的下一代益生菌治療和預(yù)防肥胖癥及其代謝共病的必要性。